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| ELISA原理2 |
| 发布时间：2012-12-14 阅读：197次 |
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(1)戊二醛二步法) M ~0 L+ l# k! D
1) 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。6 C, Q8 j& r" m
2)标记步骤：
(1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。5 k* k) F9 F5 V% \\
(2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml／1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。: e6 V. j! |, b8 _
(3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。) K+ P! L- q7 ]: j" q3 |3 d+ J# c3 j
(5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。+ \\0 Y( I* K3 j# M+ ]
(6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
(7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。6 s* w9 j F" v4 N9 R- A+ ~
(8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。
3)结果判定：5 l5 y# N% b0 A* V" T2 w5 b. \\) B
(1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。) y# a) a- z1 u5 t) t# Y4 N0 y/ u
(2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。6 o! G4 ]6 }3 }! K* E: P
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.48 z& Q/ M8 t3 [# D0 R) i5 k h/ \\
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62& I3 X) m+ {) X- E$ M
酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 49 S- O, `! i8 w
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2~4％的酶与蛋白质结合。
4)试剂及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。
(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。% ]# ^- G3 @- p1 n. x
(3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
(4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。" D1 w8 \\, r& \\ A2 Q
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
(6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。9 H7 O2 f o0 {( {# M" M N
(7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。& y" t* I1 j! L" t- M- W7 r9 R
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
(11) 搅拌器，分光光度计，离心机。0 c3 J, R3 p. c W$ J, T0 I: B
(12) 透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。
r& i% D. }& q: Z K9 e! E0 d
(2)简易过碘酸钠法% E0 O+ v: s2 T
本法是以NaIO４先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70％的HRP和Ig结合，99％的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前常用的方法。7 p3 C# @, w9 L5 i% F% @7 r9 Z
1)原理：; h d) X" E" u _& O5 y
经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
8 n% @9 _& U8 s6 V2)标记步骤:
(1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。1 U0 |) i L/ Y/ ?. ]
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟。: |+ }% L" N7 ?4 e2 g
(3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。9 U# ^& ~. [7 @
(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。# B+ T" n; v7 C" F* H5 }
(6) 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。0 m# a# G5 V# x, S7 p, B
其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。
3)结果判定：
除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。5 {% ^% U/ T X- Z0 U- a
IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62( Q: p$ f" X, F0 }; s
4)试剂及器材:1 x- R+ T/ e$ i" Q
(1) 0.1M NaIO4：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
(2) 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液: ?. p" \\5 N) ?( K
0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml+ r% g; o& m2 r7 t4 O
0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml
加蒸馏水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:3 ?! \\$ z* p7 ]" g& X. E) z( f
Na２CO３ 0.32克; s3 C. i! A5 q1 G/ w4 {
NaHCO３ 0.586克: H% E M! O w- M
加蒸馏水至50ml
再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
(4) NaBH４溶液(4mg／ml):
临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。+ h( i* [6 J, H% T
(5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。! C$ F/ f. C( I1 f# U0 m5 J7 T, p
3．工作浓度的选择
在免疫酶技术中，先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４ 0.05ml终止反应。$ J/ A& ]3 Y: S
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。
C要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中，因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法)，以达到适的实验条件。( U3 Z* A4 l o$ {/ f0 M0 _
4．注意事项
1. 在具备高质量HRP的条件下，所要标记的抗体也要活性高,效价高(低1∶16),纯度高，亲和力好，这是保证标记物效价高，免疫活性好的要条件。" i! t$ {2 f0 g8 |
2. 所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂，(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品，因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则，影响标记效果。3 e0 t3 r9 d/ K+ H9 O; J l
3. 室温搅拌时须避光，室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前，须认真检查，防止漏液。
4. 浓的标记物相当稳定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀释成1∶10，只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。 |
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