辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得深入的一种过氧化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。
   辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质，HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，Mr在40000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。酶催化的适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而0.62饱和度以上则不溶。该酶适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63℃，在15min内稳定。氧化还原电势很低，pH6.08时，E 0 =-0.2070V，pH为7.71时，E′0 =-0.2787V。HRP的辅基和酶蛋白大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b
       酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。% O+ R( k8 y, u& R! }
　　酶制剂及其底物
　　凡性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：3 D/ Y2 U# ~  S d( r* a" Z X8 g
       (1)来源方便，易于纯化；
   (2)比活性高，性质稳定；9 z& g$ X- l$ D) C9 r# U7 a0 C
       (3)酶活性和量能+ I  w/ ^& O9 ]
       用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。8 ]- v7 V! ~( c( E- }" W$ A: e" I" s
       由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。* k4 |7 U# q# b% ^- t" \\
       HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
　　　　　　　　　　　　　　　HRP2 ~2 y( w9 E+ M
　　　　　　　　 DH2＋H2O2────→D＋2H2O
   供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。S(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色，现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是：OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色，后者产物为蓝绿色，二者的可溶性均好，在避光处颜色稳定，空白可近于无色，灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外，还有一种供氢体称ABTS[2, 2-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反应产物呈蓝绿色，且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面，ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
   由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰(说明H2O2已消耗殆尽)。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。+ c0 `# W2 }$ k* k& p
酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff碱而结合。后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
2．实验步骤- W a$ D( e2 i0 b
       HRP的制备 
   1).水提取：称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣根皮中亦含有丰富的HRP)，用菜刀切成小碎块，在绞肉机中绞碎1～2次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或离心机)甩干，收集滤液，碎渣再用1/4倍体积水浸泡提取1次，合并2次滤液，测得总体积。. K0 p3 I5 F1 U" R: J
       2).硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每1000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末(相当于0.40饱和度，0℃)，大约在1~2h内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以3 000r/min离心15min，弃沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度)随加随搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000r/min离心20min，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止)，分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1～2天，直到硫酸铵透析完毕为止(可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min，弃去沉淀，量上清液的体积。 0 c4 N; R: ^/ ~: F! T$ J7 G
       3).丙酮分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰盐浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿杯壁加入1倍体积预冷至－15℃的丙酮，放置片刻，在冰冻离心机中以4000r/min离心15min，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积)-15℃丙酮，(操作同上)，静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除去丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。
   4).精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol/L硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10 -3 mol/L，5 000r/min离心10min，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，用水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥(约得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的RZ值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。 3 y; ~/ O3 z+ B& A1 d