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ELISA试剂盒使用要点与常见问题
发布时间:2018-09-03 阅读:348
Elisa生物试验是一种敏感性高,特异性强,重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒适用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗体ELISA检测。ELISA试剂盒应用定性夹心免疫检测技术,用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板条,这些多肽是型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很强的肽段,分别来自于该毒株的开放阅读框2和开放阅读框3。将样品或标准品加入孔中并孵育,如果其中存在HEV IgM抗体,这些抗体就会与HEV 的多肽抗原结合,并固定在上面,洗板除去其它非特异性抗体和样品中的其它成份。然后加入羊抗人IgM-HRP(辣根过氧化物酶)酶结合物,经第二次孵育后,酶结合物就会与次孵育结合上的HEV IgM抗体相结合,洗板除去未结合的酶结合物,加入TMB底物溶液,在第三次孵育时会发生酶-底物反应,只有那些含有HEV IgM抗体和酶结合物所形成的复合物的孔才会发生颜色变化,加入硫酸溶液终止酶和底物间的反应,并在波长: 450nm处测量O.D.值,按照本HEV IgM抗体elisa试剂盒的测试标准, O.D.值大于或等于Cut-Off值的样品被认为是初试阳性。
一、ELISA试剂盒使用要点
样本的准备:尽量使用新鲜样本,不使用有溶血,被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全的样本。ELISA检测宜采集新鲜标本,如不能立即测定,5天之内应4℃保存,对于1周后检测的样本应低温冻存;做好分装,长时间冻存的样本避免反复冻融。
仔细阅读说明书,熟悉整个流程,推荐画出简要步骤图;提前准备试剂,比如常见20X洗涤液是浓缩液,需要用超纯水提前稀释准备好。一般的检测抗体和酶标二抗需要用对应的稀释液稀释至工作浓度。
不同批次的试剂不要混用,检查各组分的有效期。
预包被的酶标板条和各试剂组份需要室温平衡30 min以上,这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需温度,预防后续实验中由于孵育温度或是时间不够充分,而将一些弱阳性样本不能检出。
待测样本加样:待检样本过多时,建议分批操作;需要稀释的样本提前做好稀释,注意选对合适稀释液;控制好加样时间,避免加样费时过长造成误差;注意加样角度,垂直加入孔底,不要接触孔壁, 做到一份样本一个移液头,防止交叉污染。 
温育和洗板:温育时间和温度一般根据试剂盒的说明书进行选择。温育时可以采用水浴或者湿盒孵育,避免“边缘效应”。①手工洗板时,拍板时要垂直,避免交叉污染,用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离;②洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅。
显色:市售ELISA 试剂盒中,一般是以四甲基联苯胺(TMB)为底物的显色液,反应条件为37℃或室温反应15~30 min。显色反应需要避光。
读数和数据分析:终止后读取结果尽量在15min内完成,读取OD值时酶标仪需先预热15~30 min再进行。数据分析一般用四参数和直线拟合法,选择哪种拟合方式,可以依据标曲的相关系数(R2)来确定,R2一般需要大于0.99。
二、ELISA试剂盒常见问题分析
1、阳性对照不显色
 漏加阳性对照
 阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂 
 阳性对照受污染
2、阳性对照显色浅(HBeAb  HBcAb阴性对照显色浅)
试剂和保存不当、活性下降
在使用前试剂盒未放置在室温平衡
温育时间不够或孵育温度过低
洗板浸泡时间过长、洗板次数过多
使用不正确的洗液
 洗液中含有防腐剂同时残留量过多
洗板后酶标板被干透
读数时使用波长不正确
滤光片不清洁或滤光片位置错误
读数时酶标板放置位置错误
阳性对照活性下降
酶标失活
3、阴性对照显色(HBeAb、HBcAB除外)
实验过程受污染
阴性对照污染
酶滴在孔壁上
4、整板不显色
试剂和保存不当、已经失活
忘记加酶、可检查滴瓶内酶量
忘记加抗原或中和试剂
忘记加显色剂A或显色剂B
5、阳性对照读数不正常
加入标本后未进行必要的混匀
标本稀释错误
加样量不正确
冷冻标本未完全溶解混匀
标本中含有防腐剂
6、血清本底高
试剂盒灵敏度高
加样时使用同一枪头、交叉污染
孵育时间过长或温度过高
洗板次数不足,浸泡时间短
洗板时洗液量少或残留量多
洗板时洗液量过多、串孔
洗板机管道中有霉菌生长
洗液瓶混用
洗板机洗板头阻塞或洗板机洗板头位置错误
 配置洗液的去离子水或蒸馏水被污染
终止液浓度不够,没有充分混匀,或终止液被污染
读数时酶标板底部有水蒸气凝结
酶标仪偏差
7、假阳性结果
实验器具被污染
血清中出现纤维蛋白凝集
血清标本中出现过多的红细胞
血浆标本处理不当
标本中含有灰尘、颗粒或细菌等
标本被反复冻融
加标本后进行不正确的振荡
沿孔壁上加入标本,加样后出现过多的气泡
酶标滴加在孔壁上,洗板未洗净
混用洗液或洗液稀释错误
洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌
洗板次数不足或浸泡时间短
洗板时洗液量少或残留量多
洗板时洗液量过多、串孔
读数时酶标板底部有水蒸气凝结
洗液瓶、废液瓶混用
 读数过程中板孔中有气泡
酶标仪偏差
8、同一板内重复性差
标本混匀不充分
试剂混匀不充分
标本与酶结合物混匀不充分
加样技术差异
加样器故障或加样器被污染
加样时间过长导致孵育时间不同
孵育器内部的温度不一致,造成酶标板孔间的孵育温度差异
读数时酶标板孔间有气泡
9、HCV血清本底高
灵敏度高
样本稀释液加液量不足100ul
枪头深入血清过深,致使外壁沾有血清导致加样偏多(>10ul)
同一孔加了两次样本
其他可能原因参考HBsAg
10、HIV阳性对照低
误将阳性对照稀释
阳性对照未混匀
加液量不足
其他可能原因参考HBsAg
11、HIV血清本底高
标准变更,灵敏度提高
标本稀释液加液量不足100ul
枪头深入血清过深,致使外壁沾有血清导致加样偏多(>10ul)
同一孔加了两次样本
其他可能原因参考HBsAg

 
 

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