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关于ELISA试剂盒的使用,你需要了解这些内容 |
发布时间:2018-03-17 阅读:294次 |
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温育和洗板:温育时间和温度一般根据试剂盒的说明书进行选择。温育时可以采用水浴或者湿盒孵育,避免“边缘效应”。①手工洗板时,拍板时要垂直,避免交叉污染,用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离;②洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅。
显色:市售ELISA 试剂盒中,一般是以四甲基联苯胺(TMB)为底物的显色液,反应条件为37℃或室温反应15~30 min。显色反应需要避光。
读数和数据分析:终止后读取结果尽量在15min内完成,读取OD值时酶标仪需先预热15~30 min再进行。数据分析一般用四参数和直线拟合法,选择哪种拟合方式,可以依据标曲的相关系数(R2)来确定,R2一般需要大于0.99。
样本的准备:尽量使用新鲜样本,不使用有溶血,被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全的样本。ELISA检测宜采集新鲜标本,如不能立即测定,5天之内应4℃保存,对于1周后检测的样本应低温冻存;做好分装,长时间冻存的样本避免反复冻融。
仔细阅读说明书,熟悉整个流程,推荐画出简要步骤图;提前准备试剂,比如常见20X洗涤液是浓缩液,需要用超纯水提前稀释准备好。一般的检测抗体和酶标二抗需要用对应的稀释液稀释至工作浓度。
不同批次的试剂不要混用,检查各组分的有效期。
预包被的酶标板条和各试剂组份需要室温平衡30 min以上,这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需温度,预防后续实验中由于孵育温度或是时间不够充分,而将一些弱阳性样本不能检出。
待测样本加样:待检样本过多时,建议分批操作;需要稀释的样本提前做好稀释,注意选对合适稀释液;控制好加样时间,避免加样费时过长造成误差;注意加样角度,垂直加入孔底,不要接触孔壁, 做到一份样本一个移液头,防止交叉污染。
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