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| 分析影响试剂盒品质的环节 |
| 发布时间：2019-07-02 阅读：246次 |
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影响试剂盒品质的环节是多方面的，除了试剂厂家要充分发挥创造智慧，研发出技术含量高而操作要求低的产品外，实验人员也应努力提高自己的专业水平和操作技能，充分了解试剂盒的性能，查找实验失败的真正原因，只有双方共同努力，才能切实提高实验室的检测水平。
一、核酸提取方法对检测质量的影响
1、煮沸法：试剂盒一般采用20%聚乙二醇6000（PEG）进行样本核酸沉淀（或富集），去除上清液后，加入碱性裂解液煮沸，离心析出的上清液即作为PCR扩增的模板。这种方法的优点是操作简单。但有以下不足：
（1）由于PEG沉淀物非常粘稠，裂解液较难彻底与之均匀混合，其混匀程度明显影响核酸的释放量，影响检测的重复性；
（2）核酸纯度低，干扰蛋白多，是试剂盒稳定性和敏感性差的主要原因；
（3）高温煮沸的核酸释放方式，大大增加实验室气溶胶污染的机会；
（4）核酸废液难以封闭收集，防污染工作难度大，严重影响低拷贝样本的准确定量。由于以上不足，目前试剂盒已少有使用。
2、微量核酸释放剂：核酸释放剂主要由碱性液体组成，与微量血清或血浆样本混匀实现核酸的简单裂解，PCR扩增反应液直接加入混合液中扩增。优点是操作简单。但有以下不足：
（1）稳定性差：原因之一是，核酸释放剂与扩增试剂为一对中合体，核酸释放剂加入量的准确度直接影响扩增反应液的pH值或改变扩增试剂的组分；其次，微量操作是个技术活！操作的要求在普通实验人员较难达到！这是直接被忽视的问题。如果把实验室工作人员组织起来进行微量操作考核，结果你就会发现，能够胜任的操作人员并不多！正因为操作“太简单”、所以很容易“被自信”，出现问题后也很难从自身去寻找原因，试剂厂家背黑锅是大概率事件！检验医学网
（2）敏感性低：除了样本加入量少之外，样本中的干扰物质也是导致敏感性不足和结果不稳定的重要因素。此外，如果试剂研发人员没有采取核酸裂解液和扩增试剂的对抗干扰措施，其检测质量难免会让用户失望。
（3）实验室污染：这种简单的操作步骤并没有避免实验室的污染，也是好多人无法理解的，但吹吸的操作不但携带出少量混合物，更重要的是Tip头有吸附核酸的特性，因此难免发生实验室的污染和核酸丢失。
3、吸附柱法：目前主要采用胍盐为介质的核酸裂解和乙醇为介质的核酸漂洗，通过这种方法制备的核酸纯度较高，但核酸丢失量大，而且丢弃的残液和吸附柱存有大量核酸，为了消除乙醇对PCR扩增的影响，吸附柱的晾干过程不但费时费力，而且增加气溶胶释放的机会。此外不能进行批量检测和自动化也是缺陷之一。洗脱的核酸残留胍盐和蛋白酶K是难免的，将不同程度影响PCR扩增的稳定性和敏感性。
4、磁珠法：其原理与“吸附柱法”相同，只不过吸附核酸的载体不是纤维素膜，而是各种大小或修饰的磁珠，磁珠的性能差异是影响试剂盒质量的重要因素，如磁珠大小、悬浮性能、表面修饰成分及磁力大小都会影响磁珠吸附核酸的能力。核酸洗脱过程如果发生磁珠成分被洗掉，那么将严重影响PCR的扩增质量。自动化和核酸富集是磁珠法的，但实验室污染发生概率要比吸附柱高的多。不同类型的磁珠导致实验室污染的程度也不同，如超悬纳米磁珠要比易沉降的大磁珠更容易发生污染，主要原因是超悬小颗粒磁珠要全部吸附到磁条一侧，所用时间要比大颗粒磁珠时间长，磁珠连同残液一起丢失的情况较难避免，这些丢失的磁珠即变成了实验室污染的元凶。
二、扩增试剂品质与检测质量
我们对市场常用的10家“丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒”的扩增试剂进行分析，发现8家扩增试剂盒的抗干扰能力和扩增效率较差，对低核酸含量样本的分辨率低，试剂盒本身容易诱发污染的环节各有不同。PCR扩增试剂的品质与采用什么样的pH值缓冲液、什么样的酶和什么样的添加剂关系密切。我们曾对多家试剂盒的反应液、酶和操作过程进行优化，试剂盒性能都有不同程度的提升，这也许归咎于当时的技术限制，但同时期不同试剂盒质量差异的确存在，只是用户没有机会或条件进行大样本验证。在扩增效率方面，能够做到线性范围样本扩增效率一致的试剂盒很少，这种荧光曲线能够“尾相接”的扩增性能，恰恰是试剂盒重复性和敏感性的灵魂。
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