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| 如何合理使用酶联免疫检测试剂盒？ |
| 发布时间：2018-05-18 阅读：444次 |
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对于新手来讲，掌握试剂盒的正确使用技巧尤为重要，那么，该如何合理使用酶联免疫检测试剂盒呢？上海继锦化学科技小编为大家整理了以下几点，供大家参考！
一、操作步骤
1.加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔 7 孔，依次加入 100μL 不同浓度的标准品 （见试剂准备 2）。空白孔加 100μL（见试剂准备第二步后一管），余孔加待测样品 100μL，酶标板加上覆膜，37℃ 温育 2 小时。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。
3.每孔加检测溶液 A 工作液 100μL（临用前配制），酶标板加上覆膜，37℃ 温育 1 小时。
4.弃去孔内液体，每孔用 300μL 的洗涤液洗涤，浸泡 1-2 分钟，吸去 （不可触及板壁） 或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次 （也可轻拍将孔内液体拍干），重复洗板 3 次。后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。
5.每孔加检测溶液 B 工作液 （临用前配制）100μL，加上覆膜，37℃ 温育 1 小时。
6.弃去孔内液体，甩干，洗板 5 次，方法同步骤 4。
7.每孔加底物溶液 90μL，酶标板加上覆膜，37℃ 避光显色 （反应时间控制在 15-25 分钟，不要超过 30 分钟。当标准孔的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔梯度不明显时，即可终止）。
8.每孔加终止溶液 50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
9.在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在 450nm 波长测量各孔的光密度 （O.D. 值）。
二、注意事项
1.试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下次使用。
2.加样：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，个孔与后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的「预温育」时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间 （包括标准品及所有样品） 控制在 10 分钟内。推荐设置复孔进行实验。
3.温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。
4.洗涤：充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响后的酶标仪读数。如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实 验过程中。
5.反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化 （比如，每隔 10 分钟观察一次），如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
6.底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。
7.如果实验室内湿度低于 60%，推荐使用加湿器提高湿度水平。
三、实验原理
将 IL12A 抗体包被于 96 孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中的 IL12A 与连接于固相载体上的抗体结合，然后加入生物素化的 IL12A 抗体，将未结合的生物素化抗体洗净后，加入 HRP 标记的亲和素，再次彻底洗涤后加入 TMB 底物显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的 IL12A 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度 （O.D. 值），计算样品浓度。
四、典型数据
为了便于计算，尽管浓度为自变量而 O.D. 值为因变量，我们绘图时仍采用标准品的 O.D. 值作为横坐标 （X 轴），标准品的浓度为纵坐标 （Y 轴）。同时为了试验结果的直观性，图中提供的是原始数据而非对数值。推荐使用对数 值建立标准曲线图。由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和温度条件等），标准曲线的 O.D. 值会有所差异。所提供的标准曲线仅供参考，实验者需要根据自已的实验建立标准曲线。
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